亨廷顿病脑源性小RNA再现了小鼠相关神经

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背景

亨廷顿病(HD)是一种由亨廷顿蛋白(HTT)基因外显子1中的CAG三核苷酸扩增引起的聚谷氨酰胺(polyQ)紊乱疾病。CAG重复序列36的HTT病会导致特异性脑细胞的进行性缺失，来自尾状核和壳核(小鼠纹状体)的中型棘神经元(MSNs)是受影响最严重的类型，且会导致运动障碍。传统观点认为，突变亨廷顿蛋白(mHTT)是HD病理生理学中的主要致病因子，其机制包括蛋白质组破坏、转录干扰和神经递质释放改变等。此外，RNA功能增益已被确定为HD和其他核苷酸重复扩增疾病的相关致病机制，如肌强直性营养不良症1型和2型、脆性X震颤共济失调综合征、脊髓小脑性共济失调、亨廷顿病样2型和肌萎缩性脊髓侧索硬化/额颞叶痴呆。

简介

年2月6日，来自西班牙巴塞罗那大学的EulàliaMartí及其团队在ActaNeuropathol(IF:14.)杂志上发表名为Huntington’sdiseasebrain?derivedsmallRNAsrecapitulateassociatedneuropathologyinmice的研究[1]。

主要结果

亨廷顿病患者在纹状体内注射来自豆状壳核的sRNA改变了野生型小鼠的运动功能，并再现了亨廷顿病分子异常

为了研究亨廷顿病患者脑中产生的sRNA是否可在体内发挥神经毒性作用，本研究建立了小鼠模型，通过该模型将从人脑组织纯化的sRNA在野生型小鼠中分别进行三项注射(图1)。

图1.研究设计示意图。使用亨廷顿病患者的冷冻脑组织以及年龄匹配的未感染个体用于纯化小RNA(sRNA)。纯化的sRNA小鼠接受小RNA测序。使用双侧套管将sRNA注射到野生型小鼠的纹状体中。采用人工脑脊液(ACSF)作为对照。对注射的小鼠进行了运动行为评估，对脑组织进行组织病理学评估和转录组学分析

为了研究HD-sRNA-PT是否会损害运动行为，在4天中(见图2a)将赋形剂、CTL-sRNA-PT或HD-sRNA-PT双边注射到野生型小鼠的纹状体中，并使用旋转棒和平衡梁测试检查它们的运动性能(图2b、c)。与注射CTL-sRNA-PT或赋形剂的小鼠相比，注射HD-sRNA-PT的小鼠在两种范式中均表现出明显的运动改变。在两次首次注射HD-sRNA-PT后，已经检测到旋转杆中的运动扰动，并在随后两次注射中恶化(图2b)。在平衡木测试中，注射HD-sRNA-PT的小鼠显示每帧的滑动次数发生变化(图2c)。值得注意的是，注射CTL-sRNA-PT的小鼠的表现与注射赋形剂的小鼠没有差异，这表明CTL-sRNA-PT不会对运动功能产生任何负面影响。

图2.纹状体内注射HD-sRNA-PT诱导野生型小鼠运动改变，并改变纹状体中几种纹状体亨廷顿病相关蛋白的水平

HD-sRNA-PT诱导与亨廷顿病相关转录特征一致的选择性基因表达改变

为了确定HD-sRNA-PT有害作用的潜在通路，在最后一次注射后2天，我们使用RNA测序技术分析了赋形剂、CTL-sRNA-PT和HD-sRNA-PT注射小鼠纹状体中的基因表达模式。在HD-sRNA-PT-对比赋形剂注射的小鼠中，我们共检测到个上调基因和个下调基因(n=8只/组，倍数变化1.5或1.5，经调整p0.05，图3a)，在比较CTL-sRNA-PT与赋形剂注射的小鼠时未发现明显失调(n=8只/组，经调整P0.05，图3b)。根据DAVID功能注释工具，对这些差异表达基因(DEGs)的功能注释显示，下调基因在神经元通路中显著富集(图3c)，而上调基因在免疫系统和免疫应答中富集(图3d)。CTL-sRNA-PT和HD-sRNA-PT实验组之间的比较仅显示DEGs(经调整P0.05)在免疫应答中富集，表明免疫基因的改变更一致。我们通过qpcr验证了注射hd-srna-pt的小鼠中的入组基因和免疫相关基因span=""(如Clcx2、Il1b、Ptgs2和Tnf)的增加。转录组学分析发现，表达了Ppp1r1b、Dlg4和ptpn5的mRNA的下调，如图2e所示。

图3.纹状体内注射HD-sRNA-PT导致类似亨廷顿病相关转录组的转录异常

鉴定潜在有毒的HD-sRNA物种

为了确定HD-sRNA-PT神经毒性的sRNA候选者，使用深度测序对CTL-sRNA-PT和HD-sRNA-PT进行了表征。sRNA的电泳图谱显示最丰富的sRNA的长度小于40nt。生物信息学分析显示，大部分丰度较低的RNA片段被定位到核糖体RNA上。然而，高浓度sRNA的成分更为复杂。该片段的大小分布分析显示，CTL-sRNA-PT样本中存在大量长度为21–22nt的序列，与miRNAs相对应。相反，32–33nt的物种是HD-sRNA-PT中最丰富的片段，并被定位到tRNAs上(图6a)。为了确定sRNA40nt的组成特征，我们使用了SeqCluster生物信息学工具。在CTL-sRNA-PT和HD-sRNA-PT样本中鉴定出约个簇，其中大部分映射到miRNAs和snoRNAs上，其次是tRNA和基因片段(图6b)。

图6.sRNA探查揭示了亨廷顿病中tRFs的高表达，其中5’tRF-Ala损害了神经元活力

结论及展望

对于亨廷顿病神经退行性变的分子基础的理解仍存在重要差距。除了通过扩增polyQ破坏mHTT蛋白诱导的多细胞过程外，现有研究已提供了转录的CAG重复RNA直接参与亨廷顿病的病理生理学证据。不同长度的CAG重复RNA产生的神经毒性可能被强烈扰动的sRNA和RAN翻译产物的有害效应所补充，因此增加了引起神经变性的机制的复杂性。尽管已报告了关于亨廷顿病中RAN翻译的神经毒性活性的确证观察结果，但这一发现阻碍了含CAG重复序列RNA产生的毒性与RAN多肽之间的区分。总之，本研究表明，来源于人类豆状壳核的人脑HD-sRNA可触发小鼠的运动协调异常，并再现了主要的亨廷顿病的病理学特征。目前的研究结果支持sRNA的协调活动(包括sCAG)可能是亨廷顿病的致病因素这一观点，并进一步表明阻断sRNA可能是一种潜在的治疗策略。

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